Изменения системы гемостаза в условиях цисплатинового моделирования прокоагулянтного статуса у аутбредных мышей-самок
М.В.Филонова1,2, Е.П.Федорова1, А.А.Чурин1,2, Л.Ю.Котловская1,2, М.А.Соловьев1, В.В.Удут1,2
1НИИФиРМ им. Е.Д.Гольдберга, Томский НИМЦ РАН, Томск РФ;
2ФГАОУ ВО Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск, РФ
При моделировании прокоагулянтного статуса у аутбредных мышей-самок однократным введением цисплатина в максимально переносимой дозе проводили мониторинг гемостаза (в течение 30 сут) с использованием методов коагулограммы и «глобального» теста — низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ). Мониторинг продемонстрировал волнообразное изменение гемостатического потенциала: структурная и хронометрическая гиперкоагуляция, регистрируемая с 1-х суток наблюдения и достигающая максимума к 5-7-м суткам, к 15-20-м суткам сменялась гипокоагуляцией и переходом к нормокоагуляции на 30-е сутки наблюдения. Это свидетельствует о пролонгированном эффекте цисплатина: формировании выраженной дисфункции эндотелия, обеспечивающего основной антикоагулянтный пул гемостаза, начиная с 1-х суток; присоединении нарушений пластической функции печени к 15-20-м суткам; купировании нарушений к 20-30-м суткам.
Ключевые слова: гемостатический потенциал; эндотелиальная дисфункция; цисплатин, низкочастотная пьезотромбоэластография; аутбредные мыши.
Многочисленные исследования демонстрируют сопряжённость химиотерапии и частоты тромбогеморрагических осложнений [1,6,7]. Цисплатину как одному из наиболее часто используемых химиотерапевтических агентов уделено пристальное внимание, особенно в контексте развития тромбогеморрагических осложнений у пациентов онкологического профиля. Основными механизмами его цитотоксического эффекта является образование аддуктов с пуриновыми основаниями ДНК клеток с одновременным развитием выраженного окислительного стресса, что приводит к активации внешнего и внутреннего пути апоптоза [2] и некроптоза [9]. При этом цисплатин, как и подавляющее большинство противоопухолевых агентов, оказывает повреждающее воздействие на все клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью, в том числе и на эндотелиальную выстилку сосудов.
Наблюдающееся при проведении химиотерапии структурное и функциональное повреждение эндотелия сосудов приводит к снижению антикоагулянтного потенциала сосудистой стенки, либерации содержимого телец Вейбла—Палладе (фактор фон Виллебранда, p-селектин и др.), образованию участков деэндотелизации и т.д., что в совокупности приводит к резкой интенсификации прокоагулянтной активности, сопровождающейся дисфункцией противосвертывающих механизмов [4]. Достаточно значимо и негативное действие химиотерапевтического агента в отношении основного органа детоксикации — печени, в частности ее пластической функции, нарушение которой может выступить триггером геморрагических осложнений [1]. В связи с этим актуальным представляется экспериментальное моделирование и мониторинг дисфункции системы регуляции агрегатного состояния крови при действии химиотерапевтических препаратов. Это позволит выявить механизмы компенсации и сроки восстановления функционального состояния гемостатического потенциала (ГП) с перспективой разработки схем фармакологической коррекции его нарушений.
Цель данного исследования — изучить влияние однократного введения цисплатина в максимально переносимой дозе на гемостатический потенциал аутбредных мышей-самок линии CD1.
Методика исследования.
Исследование проведено на мышах-самках линии CD 1 (n=160) массой 18-25 г. Животные были распределены на 2 группы: контрольную (n=80) и опытную(n=80). Мышей содержали в неполной барьерной системе в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных. Содержание животных и дизайн экспериментов одобрены комиссией по биоэтике НИИФиРМ им. Е.Д.Гольдберга. Для моделирования нарушений свёртывающей системы крови мышам вводили внутрибрюшинно однократно цисплатин (Cisplatin-LANS, ООО «ЛЭНС-ФАРМ») в максимально переносимой дозе (МПД) 10 мг/кг. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили физиологический раствор в эквивалентном объёме. Изучение показателей проводилось на 1, 2, 5, 7, 10, 15, 20 и 30-е сутки после введения цисплатина по 20 животных на каждую точку наблюдения.
Для проведения коагулологического исследования стабилизированные 3.8% раствором цитрата натрия образцы крови, полученные пункцией сердца, центрифугировали в течение 15 мин (3000 об/мин, центрифуга Pico 17; Thermo Fisher Scientific). Показатели коагуляционного звена гемостаза определяли на полуавтоматическом коагулометре Helena C-4 (Helena Biosciences Europe) с использованием наборов для исследования системы гемостаза (ООО «Технология-Стандарт»). Определяли активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ, с), протромбиновое время (ПВ, с), международное нормализованное отношение (MHO), концентрацию фибриногена (г/л).
Для оценки ГП применяли метод низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ) с использованием нативной крови, полученной пункцией сердца. Аликвоту крови в течение 15-20 с помещали в кювету (объём 0.45 мл) пьезотромбоэластографа АРП-01М «Меднорд» (ООО «Меднорд-Техника»). Оценивали следующие параметры: константу тромбиновой активности (КТА, отн. ед.), t3 (время желирования, мин), интенсивность коагуляционного драйва (ИКД, отн. ед.), t5 (время образования сгустка, мин).
Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.) с расчётом среднего значения и стандартной ошибки среднего. Межгрупповые различия оценивали с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни. Уровень значимости критерия задавали p<0.05%.
Результаты исследования.
По данным коагулограммы, однократное введение цисплатина в МПД с 5-х по 20-е сутки сопровождалось сокращением ПВ (максимальное сокращение на 7-е сутки — 20.6%; рис. 1, а) относительно соответствующих контрольных значений. Соответствующим образом изменялись и значения показателя МНО (рис. 1, б). После введения цисплатина с 7-х по 20-е сутки у животных наблюдалось увеличение концентрации фибриногена с достижением максимального значения относительно контроля — 55.6% — на 15-е сутки (рис. 1, в). Сокращение АПТВ выявлено с 7-х по 30-е сутки с наибольшей выраженностью на 20-е сутки (36% относительно контроля), (рис. 1, г). Таким образом, гиперкоагуляционный ответ на введение цисплатина определялся с 5-7-х до 20-х суток мониторинга с постепенным возвращением к физиологической норме на 30-е сутки.
Метод НПТЭГ оказался более чувствителен в отношении выявления нарушений системы гемостаза после однократного введения цисплатина [8]. Было выявлено «расслоение» гиперкоагуляционного ответа по сравнению со стандартными коагулологическими тестами. Таким образом, первичный гиперкоагуляционный ответ проявлялся на 1-е сутки после введения цисплатина и характеризовался увеличением активности тромбина на 37.8% (показатель КТА) (рис. 2, а), сокращением времени желирования крови на 14.9% (показатель t3) (рис. 2, б) и времени достижения образования поперечно-сшитого фибрина на 13.2% (показатель t5) (рис. 2, г) по сравнению с контролем. Первичный гиперкоагуляционный ответ к концу 2-х суток сменялся гипокоагуляцией, что отображалось резким снижением активности тромбина на 47.1% (показатель КТА) (рис. 2, а) и удлинением времени образования поперечно-сшитого фибрина на 6.7% (показатель t5) (рис. 2, г) по сравнению с контролем.
Максимальный гиперкоагуляционный ответ на введение цисплатина фиксировался на 5-7-е сутки, о чём свидетельствовало увеличение активности тромбина на 42% (показатель КТА) (рис. 2, а), сокращение времени желирования крови на 31.9% (показатель t3) (рис. 2, б), повышение интенсивности протеолиза фибрина на 37.8% (показатель ИКД) (рис. 2, в) по сравнению с контролем. Вторая волна гиперкоагуляции сменялась гипокоагуляционным состоянием на 15-е сутки, что проявлялось снижением активности тромбина на 32.8% (показатель КТА) (рис. 2, а), удлинением процесса желирования крови на 28.2% (показатель t3) (рис. 2, б) и снижением интенсивности протеолитического этапа фибриногенеза на 18.5% (показатель ИКД) (рис. 2, в) относительно контроля.
Постепенная нормализация состояния гемостатического потенциала наблюдалась к 30-м суткам после однократного введения цисплатина.
Таким образом, однократное введение цисплатина в максимально переносимой дозе приводит к волнообразному изменению системы гемостаза: структурная и хронометрическая коагуляция, проявляющаяся через 1 сут после введения препарата, сменялась гипокоагуляцией ко 2-м суткам. Максимально выраженный гиперкоагуляционный ответ наблюдали к 5-7-м суткам исследования, а к 15-м суткам формировалась структурная и хронологическая гипокоагуляция, с постепенной нормализацией состояния гемостатического потенциала к 30-м суткам. По результатам коагулологических тестов изменение системы гемостаза в сторону гиперкоагуляции наблюдалось лишь к 5-7-м суткам и сохранялось до 20-х суток с последующим достижением физиологической нормы к 30-м суткам.
Объяснением «волнообразности» изменений ГП — от гиперкоагуляции до гипокоагуляционного состояния — могут служить активация сосудистого эндотелия (гиперкоагуляционное состояние на 1-х сутках исследования) с либерацией прокоагулянтного содержимого телец Вайбеля—Паладе и взаимодействием клеточного звена с эндотелиоцитами; элементы коагулопатии потребления, развивающейся вследствие чрезмерно интенсифицированных механизмов коагуляции (гипокоагуляционное состояние на 2-е сутки); массивное повреждение эндотелия с образованием участков деэндотелизации с обнажением волокон коллагена, массивное поступление микрочастиц эндотелиальных клеток, обладающих прокоагулянтной активностью, обусловленной наличием «доступных для контакта» фосфатидилсерина и тканевого фактора (максимальный гиперкоагуляционный ответ на 5-7-е сутки); прогрессирующее развитие нарушения белково-синтетической функции печени (гипокоагуляционное состояние на 15-е сутки); восстановление структурно-функционального состояния эндотелия сосудов и печени (нормализация состояния гемостатического потенциала на 30-е сутки).
Сделанное нами предположение о стадийности приспособительных реакций гемостатического потенциала подкрепляется ранее полученными данными. Известно, что структурное повреждение эндотелия и апоптоз раковых клеток происходят при сходных концентрациях цисплатина в организме [4,5]. In vitro показано, что индуцированный цисплатином апоптоз эндотелиальных клеток приводит к высвобождению прокоагулянтных эндотелиальных микрочастиц, которые способны генерировать тромбин через независимые от тканевого фактора пути [7]. Кроме того, структурное повреждение эндотелиоцитов приводит к повышенной экспрессии молекул адгезии [3], что способствует интенсификации воспалительных процессов, приводящих к увеличению гемокоагуляционной активности клеточного звена. Полученные данные свидетельствуют о необходимости более пристального изучения механизмов компенсаторных реакций гемостатического потенциала в условиях применения химиотерапевтических агентов для корректировки схем первичной и вторичной профилактики развития тромбогеморрагических осложнений, ассоциированных с проведением химиотерапии.
Работа выполнена при поддержке программы повышения конкурентоспособности Томского государственного университета.
Литература.
1. Abdol Razak N.B., Jones G., Bhandari M., Berndt M.C., Metharom P. Cancer-associated thrombosis: an overview of mechanisms, risk factors, and treatment // Cancers (Basel). 2018. Vol. 10, N 10. pii: E380. doi: 10.3390/cancers10100380
2. Dasari S., Tchounwou P.B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action // Eur. J. Pharmacol. 2014. Vol. 740. P. 364-378.
3. Francescato H.D.C., Almeida L.F., Reis N.G., Faleiros C.M., Papoti M., Costa R.S., Coimbra T.M. Previous exercise effects in cisplatin-induced renal lesions in rats // Kidney Blood Press. Res. 2018. Vol. 43, N 2. P. 582-593.
4. Lechner D., Kollars M., Gleiss A., Kyrle P.A., Weltermann A. Chemotherapy‐induced thrombin generation via procoagulant endothelial microparticles is independent of tissue factor activity // J. Thromb. Haemost. 2007. Vol. 5, N 12. P. 2445-2452.
5. Li W., Lam M.S., Birkeland A., Riffel A., Montana L., Sullivan M.E., Post J.M. Cell-based assays for profiling activity and safety properties of cancer drugs. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2006. Vol. 54, N 3. P. 313-319.
6. Nasser N.J., Fox J., Agbarya A. Potential mechanisms of cancer-related hypercoagulability // Cancers (Basel). 2020. Vol. 12, N 3. pii: E566. doi: 10.3390/cancers12030566
7. Oppelt P., Betbadal A., Nayak L. Approach to chemotherapy-associated thrombosis // Vasc. Med. 2015. Vol. 20, N 2. P. 153-161.
8. Udut V.V., Solov’еv M.A., Karchagina O.S., Borodulina E.V., Tyutrin I.I., Klimenkova V.F., Malyugin E.F., Turenko A.V. Global tests in evaluation of the function of proand anticoagulant systems: Present and future // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2015. Vol. 159. N 2. P. 205-208.
9. Xu Y., Ma H., Shao J., Wu J., Zhou L., Zhang Z., Wang Y., Huang Z., Ren J., Liu S., Chen X., Han J. A role for tubular necroptosis in cisplatin-induced AKI // J. Am. Soc. Nephrol. 2015. Vol. 26, N 11. P. 2647-2658.